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如何申请专利

技术交底书模板-检测大豆锈病菌的方法

(一)技术交底书的要求:
□应清楚、完整地写明发明或实用新型的内容;
□使所属技术领域的普通技术人员能够根据此内容实施发明创造;
□使上述人员相信本发明确实可以解决现有技术不能解决的问题。
(二)技术交底书的具体样本如下:
 1)发明创造的名称:

一种检测大豆锈病菌的TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测方法及试剂盒

 2)所属技术领域:
技术领域:
      本发明涉及一种检测大豆锈病菌的TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测方法及试剂盒。
 3)背景技术
背景技术:
      3.1)详细介绍技术背景,并描述申请人所知的与发明方案最接近的已有技术(应详细介绍,以不需再去看文献即可领会该技术内容为准,如果现有技术出自专利、期刊、书籍,则提供出处);
      3.2)对现有技术存在的缺点进行客观的评述(现有技术的缺点是针对于本发明的优点来说的;如果找不出对比技术方案及其缺点,可用反推法,根据本发明的优点来找对应的缺点;本发明不能解决的缺点,不需提供;缺点可以是成本高、处理时间慢等类似问题)。

      2004年,大豆锈病菌(Phakopsora pachyrhizi Sydow)引发的大豆锈病被美国大豆种植业者列为“头号敌人”首次在美国本土发现,美国农业部海外农业局和动植物检疫局及时将该病害的发生情况通报给我国,要求我国关注该病害。美国农业部所作的风险分析报告认为,如果大豆锈病到达美国,第一年将损失6-13亿美元,如果得不到有效控制,将会对美国的大豆种植业产生重创,因此美国很可能对进口美国的大豆或豆粕采取限制措施,这可能给世界大豆市场尤其是中国的大豆进口和食品安全带来严重影响。
      大豆锈病菌主要为害叶片、茎杆和叶柄,感染大豆种子。大豆锈病严重影响大豆的产量,全世界大豆产区的产量因大豆锈病损失可达10%~80%不等 ,早期发病甚至造成绝收。目前该病在亚洲产区的为害日益猖獗,在南美和北美,也给大豆生产造成了极大威胁。美国发生的大豆锈病与中国本土的未必是同一种,中国是世界头号大豆进口国,我国的大部分地区属于温带气候,尤其是我国沿海各地常年雨量丰沛,气候湿润,非常适合大豆锈病菌的生长,这极大的增加了大豆锈病中一些我国尚未发现的生理小种或新种传入我国的可能性。因此需加强对该病的检疫,防止此病传入、传出是当前保护我国大豆生产和贸易的一个非常重要而又迫切需要解决的新任务,而建立该病菌的快速检测方法是加强口岸检疫的首要前提条件。
      国内对大豆锈病的鉴定通常利用它们的冬孢子进行比较,但大豆锈病的冬孢子阶段在田间经常观察不到。此外,早期大豆锈病菌的形态很容易和其它的病害相混淆,我国国内尚未有针对该病害的快速检测方法。
 4)发明内容
      4.1)正面描述本发明所要解决的技术问题(对应现有技术的所有缺点;本发明解决不了的,不需提供);
      4.2)清楚完整的叙述发明创造的技术方案,应结合工艺流程图、原理框图、电路图、仿真图、布局图、设备结构图进行说明(越详细越好,可与第6部分合写;发明中每一功能的实现都要有相应的技术实现方案,不能只有原理,也不能只做功能介绍;需要详细提供与现有技术的区别技术和关联技术;每个附图都应有对应的文字描述,以他人不看附图即可明白技术方案为准;所有英文缩写都应中文注释):

      对于机械产品的发明创造应详细说明每一个结构零部件的形状、构造、部件之间的连接关系、空间位置关系、工作原理等;
      对于电器产品应描述电器元件的组成、连接关系;
      对于无固定形状和结构的产品,如粉状或流体产品、化学品、药品,应描述其组分及其含量、制造工艺条件和工艺流程等;
      对于方法发明,应描述操作步骤、工艺参数等;
      4.3)简单点明本发明的关键点和欲保护点(逐项列出1、2、3、、、),并简单介绍与最好的现有技术相比,本发明有何优点(一两个自然段即可;结合技术方案来描述,做到有理有据,即用推理或因果关系的方式推理说明;可以对应所要解决的技术问题或发明目的来描述)。
发明内容:
      本发明所要解决的技术问题是:提出快速、可靠、灵敏度高、特异性强和价格便宜的检测大豆锈病菌的试剂盒和检测方法。
      本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决:
      一种检测大豆锈病菌的TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测方法,其特征在于:包括如下步骤:
      A、将待测物的浓度配置为10-100 ng/µL;准备如下试剂:实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix、引物和探针,
      所述引物包括:
      SEQ ID NO:1:序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物;
      SEQ ID NO:2:序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物;
      所述探针包括:
      SEQ ID NO:3:序列为5’-FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3’,其中,FAM为荧光分子,MGB为另结合了Minor Groove binder结合物;
      B、在待测物中加入步骤A中的试剂,等待扩增步骤,并检测扩增过程中待测物的荧光信号;
      C、根据待测物的报告荧光信号判定待测物是否为大豆锈病菌。
      优选的技术方案中,
      所述B步骤中反应体系总体积为10µL,其中所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix体积为5µL,所述引物浓度为0.9μM,所述探针浓度为0.2μM,所述待测物为1µL。
      所述B步骤中的扩增步骤包括如下步骤:
      B1、50C持续2分钟;
      B2、95C持续10分钟;
      B3、95C持续15秒;63C持续1分钟;
      然后循环进行所述步骤B3,直到所述步骤B3进行了40个循环为止。
      进一步优选的技术方案中,
      所述A步骤中还包括配置浓度为10-100 ng/µL的大豆锈病菌DNA模板;所述B步骤中还包括在含大豆锈病菌DNA模板的阳性对照组中加入试剂盒中的试剂,等待扩增步骤,并检测扩增过程中阳性对照组的荧光信号;在不含大豆锈病菌DNA模板的阴性对照组中加入试剂盒中的试剂,等待扩增步骤,并检测扩增过程中阴性对照组的荧光信号;在空白对照组中加入试剂盒中的试剂,等待扩增步骤,并检测扩增过程中空白对照组的荧光信号;所述C步骤为根据阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和待测物的报告荧光信号综合判定待测物是否为大豆锈病菌。
      一种检测大豆锈病菌的试剂盒,包括实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix、引物和探针,
      所述引物包括:
      SEQ ID NO:1:序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物;
      SEQ ID NO:2:序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物;
      所述探针包括:
      SEQ ID NO:3:序列为5’-FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3’的探针,其中,FAM为荧光分子,MGB为另结合了Minor Groove binder结合物。
      优选的技术方案中,
      所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix体积为5µL,所述引物浓度为0.9μM,所述探针浓度为 0.2μM。优选的技术方案中,
本发明与现有技术对比的有益效果是:
      本发明提出了一种检测大豆锈病菌的TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测方法及试剂盒,能对实际检疫和田间调查过程中所发现的病组织进行大豆锈病菌分子生物学鉴定或检测,克服了现有形态学鉴定大豆锈病方法时检测周期长、需要丰富经验的缺点,也克服了现有的分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等缺点。本发明检测快速、特异性强,特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用,对我国的出入境检验检疫意义重大。
 5)附图:实用新型专利必须提供附图,附图中构成件可以有标记,尺寸和参数不必标注。
附图说明:
      图1是采用本发明的试剂盒和检测方法对于大豆锈病菌进行检测的样品的特异性检测示意图;
      下面通过具体的实施方式并结合附图对本发明做进一步详细说明。
 6)优选具体实施方式(可与第4部分合写;尽量写明所有同样能完成发明目的的替代方案,所述替代可以是部分结构、器件、方法步骤的替代,也可以是完整的技术方案):):
      对于产品发明应描述产品构成、电路构成或者化学成分、各部分之间的相互关系、工作过程或操作步骤;对于方法发明应写明步骤、参数、工艺条件等,可提供多个具体实施方式。
具体实施方式:
      本实施例中一种检测大豆锈病菌的试剂盒包含实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3,其中,
      SEQ ID NO:1是序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物;
      SEQ ID NO:2是序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物;
      SEQ ID NO:3是序列为5’-FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3’的探针,其中,FAM为荧光分子,MGB为另结合了Minor Groove binder结合物。
      其中,实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix体积为5µL,引物浓度为0.9μM,探针浓度为0.2μM。
      一种检测大豆锈病菌的TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测方法,包括如下步骤:
      A、将待测物的浓度配置为10-100 ng/µL;准备如下试剂:实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix、引物和探针,
      其中,实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix 是使用ABI公司产品型号为4304437的混合液;
      引物包括:
      SEQ ID NO:1:序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物;
      SEQ ID NO:2:序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物;
      探针包括:
      SEQ ID NO:3:序列为5’-FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3’,其中,FAM为荧光分子,MGB为另结合了Minor Groove binder结合物。
      B、在待测物中加入步骤A中的试剂,等待扩增步骤,并检测扩增过程中待测物的荧光信号。
      其中,反应的体系总体积为10µL,各成分为:实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix 5µL,引物0.9 µM,探针0.2 µM, 待测物 1µL。
      扩增步骤为:B1、50C持续2分钟;B2、95C持续10分钟;B3、95C持续15秒;63C持续1分钟;然后循环进行所述步骤B3,直到所述步骤B3进行了40个循环为止。
      C、根据待测物的报告荧光信号判定待测物是否为大豆锈病菌。如果待测物的报告荧光信号有明显增长,则判定待测物是大豆锈病菌;如果待测物的报告荧光信号没有明显增长,则判定待测物不是大豆锈病菌。
      优选地,可以设置对照组,通过对照组的荧光信号综合判定待测物是否大豆锈病菌,提高检测准确度。
      设置的对照组包括三组:含大豆锈病菌DNA模板的阳性对照组、不含大豆锈病菌DNA模板的阴性对照组和空白对照组。检测时,配置三组对照组的DNA模板浓度为10-100 ng/µL,在三组对照组中同样加入步骤A中的试剂,且同时保证对照组和待测组的反应条件一样。检测对照组的荧光信号,综合分析待测物和三组对照组的报告荧光信号来判定待测物是否为大豆锈病菌。判定标准为:1) 若定量PCR仪检测到以大豆锈病菌DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长,阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长,而待测物的检测结果是报告荧光信号有明显增长,则表示待测物是大豆锈病菌;2) 若定量PCR仪检测到以大豆锈病菌DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长,阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长,而待测物的检测结果是报告荧光也没有荧光信号增长,则表示待测物不是大豆锈病菌。
      如图1所示,为采用本发明的试剂盒和检测方法对于大豆锈病菌进行检测的样品的特异性检测示意图。其中,横坐标表示循环个数,纵坐标表示荧光信号的增加值。其中,曲线与样品对应图如图2所示。
      结合图1和图2所示,当反应扩增40个循环后,PP1-1、PP2-3和PP3-3样品有荧光信号增加,曲线有扩增,说明PP1-1、PP2-3和PP3-3样品是大豆锈病菌;而其余样品,如UA16、U17和water没有荧光信号增加,曲线没有扩增,说明UA16、U17不是大豆锈病菌。
      从检测结果可见,采用本发明的方法检测大豆锈病菌比传统形态学方法更加快速、准确,且易于推广应用。

      以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。

专利说明书附图
图1