（一）技术交底书的要求：
□应清楚、完整地写明发明或实用新型的内容；
□使所属技术领域的普通技术人员能够根据此内容实施发明创造；
□使上述人员相信本发明确实可以解决现有技术不能解决的问题。
□应力争挖掘出解决技术问题的思路并在交底书中描述。在交底书中给出"______的问题，通过______来解决"这样的描述，力争在交底书中写出"如果用一句话来概括，这件专利想要解决的问题以及解决这个问题的核心是什么？"这句话。
水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法
2）所属技术领域：
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的快速检测技术。
3）背景技术
3.1）详细介绍技术背景，并描述申请人所知的与发明方案最接近的已有技术（应详细介绍，以不需再去看文献即可领会该技术内容为准，如果现有技术出自专利、期刊、书籍，则提供出处）；
(注：专利检索可选网站如下：1、http://pss-system.cnipa.gov.cn/sipopublicsearch/portal/uilogin-forwardLogin.shtml;2、http://www.soopat.com/;3、https://www.baiten.cn/;4、https://www.patenthub.cn/;5、http://www.innojoy.com/)
3.2）对现有技术存在的缺点进行客观的评述（现有技术的缺点是针对于本发明的优点来说的；如果找不出对比技术方案及其缺点，可用反推法，根据本发明的优点来找对应的缺点；本发明不能解决的缺点，不需提供；缺点可以是成本高、处理时间慢等类似问题）。
3.3）如果自己或本课题组/研发团队此前针对本申请的主题发表过内容相近的论文或申请过比较接近的专利，请列出并进行详细说明，包括论文投稿日期、公开日期、刊名刊号、卷期号、专利申请日期、公告日期、专利申请号等，以及文章或专利内容的简述。
背景技术：
黄单胞菌属 Xanthomonas种类繁多，致病性多样，第2版的《伯杰氏系统细菌学手册》收录了20个种，70个分类地位已经确定的致病变种和70个分类地位尚不确定的致病变种。现行的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中收录了14个检疫性黄单胞菌。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola, Xooc)是水稻上重要的细菌性病害。水稻白叶枯病菌可造成水稻减产10%～30 % ,严重时可达50 %以上。水稻细菌性条斑病菌可造成水稻减产5%～10% ,严重时可达20%。柑桔溃疡病菌（X. axonopodis pv. citri, Xac）能够侵染为害绝大多数柑桔栽培品种，是影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病菌。以上三者都是我国重要的检疫性细菌。甘蓝黑腐病菌(X. campestris pv.campestris, Xcc)是十字花科植物重要的病原菌, 在世界范围内，尤其是热带和亚热带地区引起十字花科作物如甘蓝、花椰菜和大白菜等发生黑腐病, 对蔬菜生产造成严重的经济损失。
若要有效防止上述4种黄单胞菌进境，就必须要有快速准确的诊断方法。鉴定黄单胞菌的方法主要有生理生化方法、基于PCR技术的分子生物学方法等。生理生化方法，操作步骤繁琐，一般鉴定一种菌需要15天左右的时间，太耗时，而且相关人员需要丰富的经验。基于PCR技术的分子生物学，对黄单胞菌检测主要有普通PCR、双重PCR、实时荧光PCR和滚环扩增等方法；这些方法存在易污染、灵敏度低, 而且每次只能检测一种致病菌等不足。
4）发明内容
4.1）正面描述本发明所要解决的技术问题（对应现有技术的所有缺点；本发明解决不了的，不需提供）；
4.2）清楚完整的叙述发明创造的技术方案，应结合工艺流程图、原理框图、电路图、仿真图、布局图、设备结构图进行说明（越详细越好，包括本发明的总体构成（列出本发明的完整部件/流程及其连接关系/时序关系），可与第6部分合写；发明中每一功能的实现都要有相应的技术实现方案，不能只有原理，也不能只做功能介绍；需要详细提供与现有技术的区别技术和关联技术；每个附图都应有对应的文字描述，以他人不看附图即可明白技术方案为准；所有英文缩写都应中文注释）：
对于机械产品的发明创造应详细说明每一个结构零部件的形状、构造、部件之间的连接关系、空间位置关系、工作原理等；
对于电器产品应描述电器元件的组成、连接关系；
对于无固定形状和结构的产品，如粉状或流体产品、化学品、药品，应描述其组分及其含量、制造工艺条件和工艺流程等；
对于方法发明，应描述操作步骤、工艺参数等；注意请务必给出流程图，并对流程图的各个方框进行标号，并借助标号指出每个方框在正文中所对应的说明文字的位置。
4.3）简单点明本发明的关键点和欲保护点（逐项列出1、2、3、、、），并简单介绍与最接近的现有技术相比，本发明有何优点（一两个自然段即可；结合技术方案来描述，做到有理有据，即用推理或因果关系的方式推理说明；可以对应所要解决的技术问题或发明目的来描述）。
应力争挖掘出解决技术问题的思路并在交底书中描述。在交底书中给出"______的问题，通过______来解决"这样的描述，力争在交底书中写出"如果用一句话来概括，这件专利想要解决的问题以及解决这个问题的核心是什么？"这句话（用不超过30个字说明本发明的发明点）。
发明内容:
本发明的目的是克服以上技术缺陷，提供一种快速检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌的方法。
水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，包括如下步骤：
a、提取DNA:提取检测样本的基因组DNA,制得DNA溶液；
b、DNA模板PCR反应：以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR产物；其中，
引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA 多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰；
c、杂交：将PCR产物与基因芯片上的特异性探针杂交；其中，特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌；
d、采集杂交结果；
e、分析判断：根据采集到的杂交结果，分析杂交结果是否为阳性，如果特异探针呈阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病菌。
进一步地，所述基因芯片上的探针还包括阳性定位点探针Pos-ck，其具有如下序列，
阳性定位点探针Pos-ck：NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG；
步骤c还包括阳性定位点探针Pos-ck与检测阳性定位点探针的互补链探针AntiPos-ck杂交的步骤，互补链探针AntiPos-ck具有如下序列，
互补链探针AntiPos-ck：Cy5-CCAAATTGATCCCACCC；
步骤e还包括将探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1、探针Xcc-S2杂交结果与阳性定位点探针Pos-ck杂交结果进行比较的步骤，杂交结果相同则为阳性。
进一步地，所述基因芯片上的探针还包括阴性质控探针Neg-CK，其具有如下序列，
阴性质控探针Neg-CK：NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC。
进一步地，步骤d采用激光共聚焦扫描仪扫描、软件分析得到。
进一步地，步骤a之前还包括菌种的培养的步骤；具体地，菌种的培养是指30 ℃下、将检测样本在营养琼脂培养基上培养2-3天。
本发明的再一目的是提供一种用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的PCR引物和特异探针，PCR引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA 多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰；
特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌。
本发明的第三目的是提供一种用于检测水稻白叶枯病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG；
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA 多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌DNA进行PCR扩增，探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明的第四目的是提供一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA 多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻细菌性条斑病菌DNA进行PCR扩增，探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明的第五目的是提供一种用于检测柑桔溃疡病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据柑桔溃疡病菌的RNA 多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对柑桔溃疡病菌DNA进行PCR扩增，探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明的第六目的是提供一种用于检测甘蓝黑腐病菌的引物PSRG-F/PSRG-R和探针Xcc-S2，引物PSRG-F/PSRG-R和探针探针Xcc-S2具有如下序列，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
引物PSRG-F/PSRG-R根据甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对甘蓝黑腐病菌DNA进行PCR扩增，探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明提供的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，通过采用引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物同时对检测样本潜在的4种病菌的DNA模板进行PCR反应，因此速度快。通过基因芯片上设置的特异性探针与PCR产物杂交，能快捷准确得出反应结果阳性与否，这种杂交方法不易污染、灵敏度高；采用基因芯片杂交结果判断检测结果，技术人员无需丰富的形态学知识和经验，检测结果直观明确。（即：目前的检测方法太耗时、易污染、灵敏度低的技术问题，通过采用引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物同时对检测样本潜在的4种病菌的DNA模板进行PCR反应以及通过基因芯片上设置的特异性探针与PCR产物杂交来解决）
5）附图：实用新型专利必须提供附图，附图中构成件可以有标记，尺寸和参数不必标注。
附图说明:
图1是基因芯片杂交结果一；
图2是基因芯片杂交结果二；
图3是基因芯片杂交结果三；
图4是基因芯片杂交结果四；
图5是基因芯片杂交结果五；
图6是基因芯片杂交结果六；
图7是基因芯片杂交结果七。
6）优选具体实施方式（可与第4部分合写，具体实施方式中包括：实验例的完整描述及实验数据及对实验数据的解读，以及比较例的完整描述及比较例的数据结果和对数据结果的解读；尽量写明所有同样能完成发明目的的替代方案，所述替代可以是部分结构、器件、方法步骤的替代，也可以是完整的技术方案）：
对于产品发明应描述产品构成、电路构成或者化学成分、各部分之间的相互关系、工作过程或操作步骤；对于方法发明应写明步骤、参数、工艺条件等，可提供多个具体实施方式。
具体实施方式：
实施例1
检测样本A是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，包括如下步骤：
a、提取DNA:在30 ℃下、将检测样本A在营养琼脂培养基上培养2-3天；提取检测样本的基因组DNA,制得DNA溶液；
细菌基因组DNA的提取是公知技术，本实施例中具体操作如下：1) 1.5 mL 菌液,室温13000 r/min离心5 min, 去上清；2) 取沉淀加浓度为50 g/L的溶菌酶100 μL, 悬浮菌液, 37°C, 放置2 h；3) 加入TE 385 μL, 20% SDS 15 μL, 煮沸10 min；4) 用等体积的酚氯仿抽提, 充分振荡混匀,4 ℃ 13000 r/min 离心5 min,将上清移至灭菌离心管；5) 加1 mL 冰无水乙醇,-20℃ 放置30 min 以上, 沉淀DNA；6) 4 ℃ 13000 r/min 离心10 min, 弃上清, 冰无水乙醇洗涤1 次, 75%乙醇洗涤2 次, 溶解于100 μL ddH2O, -20℃ 保存备用。
b、DNA模板PCR反应：以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR产物；其中，
引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT；
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA 多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；
引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；
引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰；
PCR反应体系为：0.25 mmol/L 10 ×Buffer (Mg2+ free) (大连宝生物)、2.0 mmol/L MgCl2 (大连宝生物)、0.2 mmol/L CY5-dNTPs(Amersham Biosciences 公司)、正向引物（XrpoD-F，PSRG-F）和反向引物（XrpoD-R，PSRG-R）各0.2μmol/L、1 U Taq 酶(大连宝生物)、模板DNA 10～20 ng,总体积25μL。标记PCR 扩增在T3 PCR 仪(德国Biometra 公司) 上进行,扩增条件为: 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,共30 个循环；72 ℃10 min。
c、杂交：将PCR产物、互补链探针AntiPos-ck与基因芯片上的特异性探针杂交；其中，基因芯片上的探针包括特异性探针Xoo-S1、特异性探针Xooc-S1、特异性探针Xac-A1、特异性探针Xcc-S2、阳性定位点探针Pos-ck和阴性质控探针Neg-CK，各探针分别具有如下序列：
互补链探针AntiPos-ck：Cy5-CCAAATTGATCCCACCC；
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
阳性定位点探针Pos-ck：NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG，
阴性质控探针Neg-CK：NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC，
互补链探针AntiPos-ck是阳性定位点探针Pos-ck的互补链探针，该探针可与阳性定位点探针Pos-ck杂交并使得阳性定位点探针Pos-ck显示阳性；探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌；
基因芯片上还设置有空白对照，基因芯片上各特异性探针、阳性定位点探针、阴性质控探针和空白对照具有表1所示的布局：
表1
Pos-ck |
Pos-ck |
Pos-ck |
Pos-ck |
Pos-ck |
Pos-ck |
Pos-ck |
Pos-ck |
Pos-ck |
Pos-ck |
Pos-ck |
Pos-ck |
Xoo-S1 |
Xoo-S1 |
Xoo-S1 |
Xoo-S1 |
Xoo-S1 |
Xooc-S1 |
Xooc-S1 |
Xooc-S1 |
Xooc-S1 |
Xooc-S1 |
Pos-ck |
Xac-A1 |
Xac-A1 |
Xac-A1 |
Xac-A1 |
Xac-A1 |
Xcc-S2 |
Xcc-S2 |
Xcc-S2 |
Xcc-S2 |
Xcc-S2 |
Pos-ck |
Neg-CK |
Neg-CK |
Neg-CK |
Neg-CK |
Neg-CK |
空白对照 |
空白对照 |
空白对照 |
空白对照 |
空白对照 |
芯片基片选择晶芯光学级醛基基片(北京博奥生物有限公司)；探针用TE缓冲液（pH 8.0）稀释至终浓度40μmol/L,将50 % DMSO加入384 孔板中，再加入等量的探针溶液,轻轻混匀，并按表1设计的探针顺序，用芯片点样仪(德国GeSim公司) 将探针点至基片上；点样后基片经37 ℃水合12 h ,用0.2 % SDS 溶液漂洗5 min；去离子水分别漂洗3 次，每次2 min；再将基片放入0.2 % NaBH4封闭液中漂洗15 min，前5 min搅拌，中间5 min静置，后5 min搅拌；去离子水漂洗3次, 每次2 min；2 000 r/min 室温离心2 min, 4 ℃避光保存；用激光共聚焦扫描仪GenePix 4200A (美国Axon 公司) 对基片进行预扫描质检；
杂交过程如下：分别取杂交液7μL(2%SDS和5%SSPE等体积混合)、PCR产物6μL 和互补链探针AntiPos-ck 1μL,混匀后95 ℃变性5 min，立即于冰水中放置5 min。将变性后的混合物加入基因芯片点样区,盖上盖玻片置于湿盒中50 ℃避光杂交3 h。杂交后的基因芯片依次在洗液Ⅰ(0.3 ×SSC ,0.2 % SDS) 和洗液Ⅱ(0.06 ×SSC) 中各清洗2 min,室温 2 000 r/min 离心2 min。
d、采集杂交结果；用激光共聚焦扫描仪扫描基因芯片,用GenePix 5.0 软件分析扫描得到的图像，杂交结果如图1所示。
e、分析判断：根据采集到的杂交结果，同时参照基因芯片上的阳性定位点探针Pos-ck杂交结果、阴性质控探针Neg-CK和空白对照，判断探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2的杂交结果阳性与否，来判断检测样本A中是否含有探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2对应的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌。如果特异探针呈阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病菌。
在本实施例中探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2均为阳性，因此检测样本A含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌。
实施例2
检测样本B是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图2所示，即探针Xoo-S1为阳性，因此检测样本B含有水稻白叶枯病菌,不含水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌。
实施例3
检测样本C是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图3所示，即探针Xooc-S1为阳性，因此检测样本C含有水稻细菌性条斑病菌,不含水稻白叶枯病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌。
实施例4
检测样本D是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图4所示，即探针Xac-A1为阳性，因此检测样本D含有柑桔溃疡病菌,不含水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌。
实施例5
检测样本F是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图5所示，即探针Xcc-S2为阳性，因此检测样本E含有甘蓝黑腐病菌,不含水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和柑桔溃疡病菌。
实施例6
检测样本F是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图6所示，即探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2均为阴性，因此检测样本F不含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种病菌。
实施例7
用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的PCR引物和特异探针，PCR引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT。
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA 多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；并且引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰。
特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌。
实施例8
用于检测水稻白叶枯病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG。
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA 多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌DNA进行PCR扩增，探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例9
用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG。
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA 多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻细菌性条斑病菌DNA进行PCR扩增，探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例10
用于检测柑桔溃疡病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据柑桔溃疡病菌的RNA 多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对柑桔溃疡病菌DNA进行PCR扩增，探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例11
用于检测甘蓝黑腐病菌的引物PSRG-F/PSRG-R和探针Xcc-S2，引物PSRG-F/PSRG-R和探针探针Xcc-S2具有如下序列，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC。
引物PSRG-F/PSRG-R根据甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对甘蓝黑腐病菌DNA进行PCR扩增，探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例12～28采用已知样本病菌作为检测样本，并采用实施例1完全相同的检测方法进行检测，以验证引物、探针的有效性和特异性；各实施例具体数据如表2所示。
表2
实施例 |
检测样本序号 |
样本名称 |
来源 |
检测结果 |
结论 |
12 |
G |
水稻白叶枯病菌 |
南京农业大学 |
探针Xoo-S1呈阳性 |
探针Xoo-S1及引物对样本病菌有效 |
13 |
H |
水稻白叶枯病菌 |
南京农业大学 |
探针Xoo-S1呈阳性 |
探针Xoo-S1及引物对样本病菌有效 |
14 |
I |
水稻白叶枯病菌 |
中国检验检疫科学研究院 |
探针Xoo-S1呈阳性 |
探针Xoo-S1及引物对样本病菌有效 |
15 |
J |
水稻细菌性条斑病菌 |
南京农业大学 |
探针Xooc-S1呈阳性 |
探针Xooc-S1及引物对样本病菌有效 |
16 |
K |
水稻细菌性条斑病菌 |
南京农业大学 |
探针Xooc-S1呈阳性 |
探针Xooc-S1及引物对样本病菌有效 |
17 |
L |
水稻细菌性条斑病菌 |
中国检验检疫科学研究院 |
探针Xooc-S1呈阳性 |
探针Xooc-S1及引物对样本病菌有效 |
18 |
M |
柑桔溃疡病菌 |
南京农业大学 |
探针Xac-A1呈阳性 |
探针Xac-A1及引物对样本病菌有效 |
19 |
N |
柑桔溃疡病菌 |
中国检验检疫科学研究院 |
探针Xac-A1呈阳性 |
探针Xac-A1及引物对样本病菌有效 |
20 |
O |
甘蓝黑腐病菌 |
南京农业大学 |
探针Xcc-S2呈阳性 |
探针Xcc-S2及引物对样本病菌有效 |
21 |
P |
甘蓝黑腐病菌 |
中国检验检疫科学研究院 |
探针Xcc-S2呈阳性 |
探针Xcc-S2及引物对样本病菌有效 |
22 |
Q |
玉米细菌性枯萎病菌 |
深圳出入境检验检疫局动植中心 |
探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1、探针Xcc-S2均阴性 |
探针相对样本病菌具有特异性 |
23 |
R |
西瓜果斑病菌 |
中国农业大学种子健康检测中心 |
同上 |
探针相对样本病菌具有特异性 |
24 |
S |
洋葱腐烂病菌 |
中国农业大学种子健康检测中心 |
同上 |
探针相对样本病菌具有特异性 |
25 |
T |
番茄细菌性溃疡病菌 |
中国农业大学种子健康检测中心 |
同上 |
探针相对样本病菌具有特异性 |
26 |
U |
玉米细菌性萎蔫病菌 |
中国农业大学种子健康检测中心 |
同上 |
探针相对样本病菌具有特异性 |
27 |
V |
马铃薯环腐病菌 |
中国农业大学种子健康检测中心 |
同上 |
探针相对样本病菌具有特异性 |
28 |
W |
菜豆晕疫病菌 |
中国农业大学种子健康检测中心 |
同上 |
探针相对样本病菌具有特异性 |
由表1可知，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌有效扩增, 引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌三种黄单胞菌有效扩增，探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1、探针Xcc-S2具有特异性。
实施例1～６、１２～２８均设置了用于质控杂交、方便判断杂交结果阳性与否的阳性定位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照；阳性定位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照，不是本发明中所必需的，熟练的检测人员可以在不设置阳性定位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照的情况下做好杂交质控、判断杂交结果阳性与否。
图1
图2
图3
图4
图5
图6
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