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如何申请专利

技术交底书模板-蛋白质表达的方法

(一)技术交底书的要求:
□应清楚、完整地写明发明或实用新型的内容;
□使所属技术领域的普通技术人员能够根据此内容实施发明创造;
□使上述人员相信本发明确实可以解决现有技术不能解决的问题。
(二)技术交底书的具体样本如下:
 1)发明创造的名称:

生产分泌性三聚受体类似物和生物活性融合蛋白的方法与组合物

 2)所属技术领域:
技术领域:
      本发明涉及蛋白质表达的方法,更具体来说涉及产生和表达例如三聚可溶性受体的分泌性和生物活性的三聚蛋白的方法。
 3)背景技术
      3.1)详细介绍技术背景,并描述申请人所知的与发明方案最接近的已有技术(应详细介绍,以不需再去看文献即可领会该技术内容为准,如果现有技术出自专利、期刊、书籍,则提供出处);
      3.2)对现有技术存在的缺点进行客观的评述(现有技术的缺点是针对于本发明的优点来说的;如果找不出对比技术方案及其缺点,可用反推法,根据本发明的优点来找对应的缺点;本发明不能解决的缺点,不需提供;缺点可以是成本高、处理时间慢等类似问题)。
背景技术
      在例如人的多细胞生物体中,细胞通过所谓的信号转导途径彼此通讯,其中分泌性配体(例如细胞因子、生长因子或激素)结合其细胞表面受体,导致受体激活。受体是膜蛋白,其由负责配体结合的胞外域、中心跨膜区和负责向下游发送信号的胞质域组成。取决于分泌信号的来源和表达受体的靶细胞的位置,信号转导可以以下三种方式发生:旁分泌(邻近细胞间通讯)、自分泌(细胞自身通讯)和内分泌(远端细胞之间通过循环进行通讯)。受体激活(其在细胞膜下面引起包括基因表达激活在内的事件级联)的一种一般机制是,多肽配体(例如细胞因子)以寡聚形式存在,例如同型二聚体(homo-dimmer)或三聚体,其当在细胞外表面结合至其单体受体时导致受体的寡聚化。信号转导途径在正常细胞发育和分化以及响应例如细菌和病毒感染的外部损害中起重要作用。在此信号转导途径中,激活不足(例如缺乏配体)或过度激活(例如配体过多)形式的异常是例如关节炎、癌症、AIDS和糖尿病的病理病状和疾病的根本原因。
      治疗这些虚弱疾病的当前策略之一涉及使用诱杀受体如仅由胞外配体结合结构域组成的可溶性受体来拦截配体,从而克服受体的过度激活。此策略的最佳实例是由Immunex(其现在是Amgen一部分)产生的Enbrel——一种二聚可溶性TNF-α受体免疫球蛋白(IgG)融合蛋白(Mohler等人, 1993; Jacobs 等人, 1997)。细胞因子的TNF家族是身体为响应感染或组织损伤而产生的一种主要促炎信号。然而,已经证明这些细胞因子的异常产生(例如在不存在感染或组织损伤下)是诸如关节炎和牛皮癣的疾病的根本原因。TNF-α受体在结合至其配体TNF-α之前在细胞表面上天然以单体形式存在,相反,TNF-α以同型三聚体(homotrimer)的形式存在(Locksley等人, 2001)。因此,将可溶性TNF-α受体与能够通过二硫键自发二聚化(Sledziewski等人, 1992和1998)的免疫球蛋白G1的Fc区融合,使得可以分泌二聚可溶性TNF-α受体(Mohler等人, 1993; Jacobs等人, 1997)。与单体可溶性受体相比,二聚TNF-α受体II-Fc融合体对同型三聚配体具有极为增大的亲和力。这为其在治疗类风湿性关节炎(RA)中的临床使用提供了分子基础,所述类风湿性关节炎是其中组成性提高的TNF-α(一种主要促炎细胞因子)起到重要致病作用的自身免疫疾病。尽管已证明Enbrel对TNF-α具有pM范围(ng/mL)内的Ki (Mohler等人, 1993),但是RA患者需要进行每周两次25 mg(其可变为用μg/mL水平的可溶性受体的形式表示)皮下注射,以达到临床效果(www.enbrel.com)。每个RA患者高水平反复消费Enbrel已经对药物供应造成极大压力以及高额费用,这仅在本国(注:指美国)就限制数百万潜在患者得到所述药物。
      除TNF-α家族的有效促炎细胞因子之外,引起AIDS的HIV病毒也使用同型三聚外被蛋白gp120以进入我们身体内的CD-4阳性T辅助细胞(Kwong等人, 1998)。HIV感染期间的一个最早期事件涉及gp120结合其在T辅助细胞的细胞表面独特表达的受体CD-4(Clapham等人, 2001)。十多年前已证明单体可溶性CD-4是抗HIV感染的有效药剂(Clapham等人, 1989),然而,当证实其功效仅限于实验室HIV分离物时(Daar等人, 1990),人们的兴奋黯然破灭。事实证明来自AIDS患者的HIV株与实验室分离物不同,其对单体可溶性CD-4具有极低的亲和力,可能是因为gp120上的序列变异(Daar等人, 1990)。尽管已经制成二聚可溶性CD-4-Fc融合蛋白,但是由于对gp120的低亲和力,这些诱杀性CD-4 HIV受体无论是在实验室还是在临床上对来自AIDS患者的天然HIV均表现出极弱的抗病毒作用(Daar等人, 1990)。
      显然,极其需要能够产生分泌性同型三聚可溶性受体或生物活性蛋白,其可具有对其天然同型三聚配体(例如TNF家族的细胞因子和HIV外被蛋白)的完美对接(dock)结合位点,因而具有更高的亲和力。理论上这种三聚诱杀受体对其三聚配体具有的亲和力应比其二聚对应物更高。这种合理设计的可溶性三聚受体类似物可显著提高临床效果以及降低各患者的药物注射量或频率。为了在治疗上切实可行,和免疫球蛋白Fc一样,所需的三聚蛋白部分理想地应为在体内含量丰富并能够有效发生自身三聚化的天然分泌蛋白的一部分。
      胶原是作为胞外基质的主要组分的纤维状蛋白质的一个家族。其为哺乳动物中含量最丰富的蛋白质,构成将近25%的体内总蛋白质。胶原在骨、腱、皮肤、角膜、软骨、血管和牙齿的形成中起着主要的结构作用(Stryer, 1988)。原纤型胶原I、II、III、IV、V和XI均被合成为称作前胶原的较大的三聚前体,其中由几百个“G-X-Y”重复(或称甘氨酸重复)组成的中央连续三股螺旋结构域的侧翼为非胶原结构域(NC)、N-前肽和C-前肽(Stryer, 1988)。C-末端和N-末端突出物均在前胶原分泌时被蛋白酶解加工,这是引发成熟蛋白质组装为形成不溶性细胞基质的胶原原纤维的事件(Prockop等人, 1998)。发现I型胶原的脱落三聚C-前肽在正常人的血液中浓度在100-600 ng/mL的范围,儿童具有较高水平,表明骨形成活跃。
      I型、IV型、V型和XI型胶原主要组装为由两条α-1链与一条α-2链(对于I型、IV型、V型来说)或者在序列上高度同型的三条不同链(对于XI型来说)组成的异型三聚形式。II型和III型胶原均为α-1链的同型三聚体。对于作为含量最丰富的胶原形式的I型胶原来说,也形成稳定的α-1(I)同型三聚体,并且在不同组织中以不同水平存在(Alvares等人, 1999)。当这些胶原C-前肽链在细胞内单独过量表达时,大部分可以自组装为同型三聚体。尽管首先合成N-前肽结构域,但是分子组装为三聚胶原始于C-前肽的定位缔合(in-register association)。据认为,C-前肽复合体通过形成链间二硫键得以稳定,但是为恰当链定位(registration)而形成二硫键的必要性不明。甘氨酸的三股螺旋重复出现,然后以拉链似的方式从发生缔合的C-末端传至N-末端。这一认识导致通过利用重组DNA技术交换不同胶原链的C-前肽而制造出非天然类型的胶原基质(Bulleid等人, 2001)。例如细胞因子和生长因子的非胶原蛋白质也已被融合到前胶原或成熟胶原的N-末端,使得可以形成新的胶原基质,这旨在使非胶原蛋白质从细胞基质缓慢释放(Tomita等人, 2001)。然而,在此两种情况下,均需要C-前肽在重组胶原原纤维组装为不溶性细胞基质之前被切割。
 4)发明内容
      4.1)正面描述本发明所要解决的技术问题(对应现有技术的所有缺点;本发明解决不了的,不需提供);
      4.2)清楚完整的叙述发明创造的技术方案,应结合工艺流程图、原理框图、电路图、仿真图、布局图、设备结构图进行说明(越详细越好,可与第7部分合写;发明中每一功能的实现都要有相应的技术实现方案,不能只有原理,也不能只做功能介绍;需要详细提供与现有技术的区别技术和关联技术;每个附图都应有对应的文字描述,以他人不看附图即可明白技术方案为准;所有英文缩写都应中文注释):
      对于机械产品的发明创造应详细说明每一个结构零部件的形状、构造、部件之间的连接关系、空间位置关系、工作原理等;
      对于电器产品应描述电器元件的组成、连接关系;
      对于无固定形状和结构的产品,如粉状或流体产品、化学品、药品,应描述其组分及其含量、制造工艺条件和工艺流程等;
      对于方法发明,应描述操作步骤、工艺参数等;
      4.3)简单点明本发明的关键点和欲保护点(逐项列出1、2、3、、、),并简单介绍与最好的现有技术相比,本发明有何优点(一两个自然段即可;结合技术方案来描述,做到有理有据,即用推理或因果关系的方式推理说明;可以对应所要解决的技术问题或发明目的来描述)。
发明概述:
      本文所公开的发明使得可将任何可溶性受体或生物活性多肽制备成三聚形式的分泌性蛋白质。本发明的实质在于使用重组DNA技术将任何可溶性受体和生物活性蛋白质同框融合到能够自身三聚化的原纤维型胶原的C-前肽域。当在真核细胞中表达时所产生的融合蛋白分泌为基本上全部为三聚形式的可溶性蛋白质,所述三聚形式由在三条C-前肽间所形成的分子内二硫键共价加强。
      本发明的一个方面公开生产分泌性三聚融合蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:(a)向真核宿主细胞内引入包含驱动开放读码框转录的启动子的DNA构建物,所述开放读码框由框内连接到待三聚化的非胶原多肽的信号肽序列组成,而所述信号肽序列又框内连接至能够自身三聚化的胶原的C-末端部分;(b)在生理条件下在适当的生长培养基中生长宿主细胞,使得可以分泌由所述DNA序列编码的三聚融合蛋白;和(c)从宿主细胞分离分泌性三聚融合蛋白。
      在一个实施方案中,信号肽序列是待三聚化的蛋白质的天然序列。在另一个实施方案中,信号肽序列来源于与待三聚化分泌性蛋白质不同的分泌性蛋白质。在一个实施方案中,待三聚化的非胶原多肽是由配体结合结构域所组成的可溶性受体。在一个实施方案中,胶原的C-末端部分是无任何胶原三股螺旋区的C-前肽(序列ID:3-4)。在另一个实施方案中,C-末端胶原由胶原三股螺旋区的一部分组成,所述部分作为与待三聚化的非胶原蛋白质的接头(序列ID:1-2)。在另一个实施方案中,胶原的C-末端部分具有突变的或缺失的BMP-1蛋白酶识别位点(序列ID:3-4)。
      本发明的一个方面公开生产分泌性三聚融合蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:(a)向真核宿主细胞内引入包含驱动开放读码框转录的启动子的DNA构建物,所述开放读码框由框内连接到待三聚化的非胶原多肽的信号肽序列组成,而所述信号肽序列又框内连接可以自身三聚化的胶原C-末端部分,所述胶原C-末端部分选自pro.α.1(I)、pro.α.2(I)、pro.α.1(II)、pro.α.1(III)、pro.α.1(V)、pro.α.2(V)、pro.α.1(XI)、pro.α.2(XI)和pro.α.3(XI);(b)在生理条件下在适当的生长培养基中生长宿主细胞,使得可以分泌由所述DNA序列编码的三聚融合蛋白;和(c)从宿主细胞分离分泌性三聚融合蛋白。
      在一个优选实施方案中,待三聚化的非胶原多肽是可溶性TNF-RII(p75)(序列ID:9-12)。在另一个优选实施方案中,待三聚化的非胶原多肽是可溶性CD-4,其为HIV的共受体(序列ID:13-16)。在另一个优选实施方案中,待三聚化的非胶原多肽是分泌性胎盘碱性磷酸酶(序列ID:5-8)。
      本发明的一个方面公开生产分泌性三聚融合蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:(a)向真核宿主细胞内引入包含驱动开放读码框转录的启动子的第一DNA构建物,所述开放读码框由框内连接到到待三聚化的非胶原多肽的信号肽序列组成,而所述信号肽序列又框内连接可以自身三聚化的胶原C-末端部分,所述胶原C-末端部分选自pro.α.1(I)、pro.α.2(I)、pro.α.1(II)、pro.α.1(III)、pro.α.1(V)、pro.α.2(V)、pro.α.1(XI)、pro.α.2(XI)和pro.α.3(XI);(b)向真核宿主细胞内引入包含驱动开放读码框转录的启动子的第二DNA构建物,所述开放读码框由框内连接到待三聚化的第二非胶原多肽的第二信号肽序列组成,而所述信号肽序列又框内连接可以自身三聚化的第二胶原C-末端部分,所述第二C-末端部分选自pro.α.1(I)、pro.α.2(I)、pro.α.1(II)、pro.α.1(III)、pro.α.1(V)、pro.α.2(V)、pro.α.1(XI)、pro.α.2(XI)和pro.α.3(XI);(c)在生理条件下在适当的生长培养基中生长宿主细胞,使得可以分泌由所述第一与第二DNA序列编码的三聚融合蛋白;和(d)从宿主细胞分离分泌性三聚融合蛋白。
      本发明的一个方面公开生产分泌性三聚融合蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:(a)向真核宿主细胞内引入包含驱动开放读码框转录的启动子的第一DNA构建物,所述开放读码框由框内连接到待三聚化的非胶原多肽的信号肽序列组成,而所述信号肽序列又框内连接可以自身三聚化的胶原C-末端部分,所述胶原C-末端部分选自pro.α.1(I)、pro.α.2(I)、pro.α.1(II)、pro.α.1(III)、pro.α.1(V)、pro.α.2(V)、pro.α.1(XI)、pro.α.2(XI)和pro.α.3(XI);(b)向真核宿主细胞内引入包含驱动开放读码框转录的启动子的第二DNA构建物,所述开放读码框由框内连接到待三聚化的第二非胶原多肽的第二信号肽序列组成,而所述信号肽序列又框内连接可以自身三聚化的第二胶原C-末端部分,所述第二胶原C-末端部分选自pro.α.1(I)、pro.α.2(I)、pro.α.1(II)、pro.α.1(III)、pro.α.1(V)、pro.α.2(V)、pro.α.1(XI)、pro.α.2(XI)和pro.α.3(XI);(c)向真核宿主细胞内引入包含驱动开放读码框转录的启动子的第三DNA构建物,所述开放读码框由框内连接到待三聚化的第三非胶原多肽的第三信号肽序列组成,而所述信号肽序列又框内连接可以自身三聚化的第三胶原C-末端部分,所述第三胶原C-末端部分选自pro.α.1(I)、pro.α.2(I)、pro.α.1(II)、pro.α.1(III)、pro.α.1(V)、pro.α.2(V)、pro.α.1(XI)、pro.α.2(XI)和pro.α.3(XI);(d)在生理条件下在适当的生长培养基中生长宿主细胞,使得可以分泌由所述第一与第二DNA序列编码的三聚融合蛋白;和(e)从宿主细胞分离分泌性三聚融合蛋白。
      以下为本发明的优点:(1)胶原是哺乳动物体内所分泌的最丰富的蛋白质,组成将近25%的体内总蛋白质;(2)胶原的主要形式天然以三聚螺旋出现,其球状C-前肽负责引发三聚化;(3)据发现,经蛋白酶解从成熟胶原释放的胶原的三聚C-前肽在哺乳动物血液中天然为亚微克/毫升水平,并且未知对身体有毒性;(4)胶原的线性三股螺旋区可作为具有预测的每残基2.9 Å间距的接头而被包括,或者被排除作为融合蛋白的一部分,从而可以精确调节待三聚化蛋白质与胶原C-前肽间的距离,以实现最佳生物活性;(5)可使将C-前肽从前胶原上切割下来的BMP1的识别位点突变或缺失,以防止三聚融合蛋白被破坏;(6)C-前肽结构域提供通用亲和标记物,其可以用于纯化本发明所制造的任何分泌性融合蛋白。
      与可以制造分泌性二聚融合蛋白的Fc标签技术(Sledziewski等人, 1992和1998)相反,本文所公开的适时的本发明首次使制造和分泌可溶性三聚融合蛋白成为可能。已知如下事实,即同型三聚体具有3重对称性,而同型二聚体具有2重对称性,因此所述两种截然不同结构形式理论上不可能完全重叠(图1)。这样,同型二聚可溶性TNF-R-Fc(例如Enbrel)和可溶性CD4-Fc融合蛋白均不可能具有分别结合其对应的同型三聚配体TNF-α与HIV gp120的最佳界面。相反,由本发明所制造的同型三聚可溶性TNF受体和CD4是三价的,在结构上具有与对应同型三聚配体完美对接的潜力。因此,这些三聚可溶性受体类似物可尤为有效地中和其三聚配体的生物活性。根据适时的本发明,可以容易且合理地设计出更为有效且更便宜的药物,例如优选实施方案中所描述的三聚可溶性TNF-R和CD4,用以对抗例如关节炎和AIDS的虚弱疾病。也可以根据本发明制造三聚可溶性gp120,其可以更好地模拟HIV病毒上所发现的天然三聚gp120外被蛋白复合体,并且用作与先前所用的非三聚gp120抗原相比更有效的疫苗。也可以根据本发明制造三聚形式的嵌合抗体,这可使抗体在中和其抗原中亲和力极大提高亲合力。
 5)附图:实用新型专利必须提供附图,附图中构成件可以有标记,尺寸和参数不必标注。
附图简述:
      图1A、图1B、图1C和图1D是本发明方法与已有二聚免疫球蛋白Fc融合体比较的示意图。
      图1A是侧视图,且图1B是俯视图:所示无配体或配体结合形式的同型二聚可溶性sTNF RII受体-Fc融合体(例如Amgen的Enbrel)的结构特征。
      标记1的结构域代表可溶性TNF-RII。应注意,Fc(标记为2,具有链间二硫键3)融合蛋白是二聚结构。由于其2重对称性,二聚Fc融合蛋白是二价的,并且因此理论上不具有结合同型三聚配体(例如具有3重对称性的TNF-α(标记4))的最佳构象。
      图1C是侧视图,图1D是俯视图:三聚可溶性sTNF RII受体-C-前肽融合的结构特征。由于其3重对称性,sTNF RII-三聚体融合蛋白本质上是三价的,因此可与其三聚配体TNF-α完全对接。能够自身三聚化的胶原的C-前肽标记为5,其具有链间二硫键3。
      图2A和图2B说明用于制造分泌性三聚融合蛋白的pTRIMER质粒载体的结构。任何编码可溶性受体或生物活性多肽的cDNA均可克隆进唯一Hind III位点或Bgl II位点,以使可以在C-末端处框内融合到含用于三聚化的C-前肽序列的α(I)胶原。图2A:pTRIMER(T0)构建物在C-前肽的上游含有部分甘氨酸重复(GXY)n;图2B:而pTRIMER(T2)仅含有具有突变BMP-1蛋白酶识别位点的C-前肽域。
      图3A和图3B说明二硫键连接的三聚胶原融合蛋白的表达和分泌。
      图3A.人胎盘碱性磷酸酶(AP)当融合到α(I)胶原的C-前肽时三聚化的Western印迹分析。将pTRIMER载体中单独编码AP或编码AP-C-前肽融合体的表达载体瞬时转染进HEK293T细胞内。48小时后,将所示各转染细胞的条件培养基(20 μL)在有或无还原剂(巯基乙醇)的等体积2×SDS样品缓冲液中煮沸5分钟,在10% SDS-PAGE上分离,并用抗AP多克隆抗体(GenHunter Corporation)进行Western印迹分析。应注意,所分泌的67 kDa AP单独不形成分子间二硫键,而所分泌的AP-T0和AP-T2融合体均有效组装为二硫键连接的三聚体。
      图3B.可溶性人TNF-RII当融合到α(I)胶原的C-前肽时三聚化的Western印迹分析。将所示pTRIMER载体内编码AP-C-前肽融合体(T2)(作为抗体特异性的阴性对照)或者人可溶性TNF-RII-C-前肽融合体的表达载体瞬时转染进HEK293T细胞内。48小时后,将所示各未经转染和经转染细胞的条件培养基(20 μL)在有或无还原剂(巯基乙醇)的等体积2×SDS样品缓冲液中煮沸5分钟,在10% SDS-PAGE上分离,并用抗人TNF-RII单克隆抗体(克隆226, R & D Systems, Inc.)进行Western印迹分析。应注意,单克隆抗体仅可识别具有二硫键的分泌性TNF-RII。可溶性TNF-RII-T0和TNF-RII-T2融合体均有效组装为二硫键连接的三聚体。
      图4和图5说明显示三聚可溶性人TNF-RII-C-前肽融合蛋白对抗人TNF-α所介导的细胞凋亡的有效中和活性的生物测定。
      图4.TNF-α敏感性WEHI-13VAR细胞(ATCC)以1百万个细胞/毫升浓度重悬于含有10% FBS的RPMI培养基中。100 μL细胞悬浮液铺于96孔微量滴定板的各孔内。向各孔内加入500 ng/mL浓度的放线菌素D,接着在所示三聚可溶性人TNF-RII-T2的存在或不存在下加入500 pg/ml人TNF-α(R & D Systems)。加入三聚AP-T2替代TNF-RII-T2作为阴性对照。在组织培养箱内温育16小时之后,用倒置显微镜以20×放大倍数检查细胞生存力,或者通过向各孔加入10%(v/v)的细胞生存力指示剂染料Alamar Blue(BioSource, Inc.)来进行检查。活细胞能够将染料从蓝色变为粉红色。应注意,三聚可溶性人TNF-RII-T2显示出抗TNF-α的有效中和活性,从而保护细胞免受TNF-α介导的细胞凋亡。
      图5.三聚可溶性人TNF-RII-T2抗人TNF-α的中和活性的定量分析。如图4A进行实验。加入Alamar Blue染料两小时后,在OD575下分析来自各孔的所示培养基。对比未添加TNF-α(100%生存力)或者添加TNF-α但未添加中和剂(0%生存力)的各孔,将读数进行归一化。
 6)序列表简述
      SEQ ID NO: 1(963个碱基)
      编码人胶原α(I)T0构建物的C-前肽的核苷酸序列。将cDNA构建物克隆进pAPtag2载体,以代替AP编码区。下划线序列代表用于构建对应pTRIMER载体的限制酶切位点。粗体密码子代表T0编码区的起点和终点。
      SEQ ID NO: 2(311个氨基酸)
      预测的人胶原α(I)C-前肽T0蛋白质序列。下划线序列代表C-前肽上游的“甘氨酸重复”区。红色的氨基酸残基表示BMP-1蛋白酶识别位点。
      SEQ ID NO: 3(771个碱基)
      编码人胶原α(I)T2构建物的C-前肽的核苷酸序列。将cDNA构建物克隆进pAPtag2载体,以代替AP编码区。下划线序列代表用于构建对应pTRIMER载体的限制性酶切位点。粗体密码子代表T2编码区的起点和终点。
      SEQ ID NO: 4(247个氨基酸)
      预测的人胶原α(I)C-前肽T2蛋白质序列。红色的氨基酸残基表示经突变的BMP-1蛋白酶识别位点的位置。
SEQ ID NO: 5(2487个碱基)
      编码融合到人α(I)胶原的T0 C-前肽的人胎盘碱性磷酸酶(AP)(AP-T0)的核苷酸序列。下划线序列表示用于融合构建物的限制位点。标记序列中部所示的融合位点的限制位点是Bgl II。
      SEQ ID NO: 6(819个氨基酸)
      预测的AP-T0融合蛋白的蛋白质序列。蓝色的氨基酸残基表示人胎盘碱性磷酸酶(AP)与α(I)胶原T0多肽间的融合位点。粗体密码子代表融合蛋白的起点和终点。下划线序列代表人α(I)胶原的C-前肽上游的“甘氨酸重复”区。红色的氨基酸残基表示BMP-1蛋白酶识别序列。
      SEQ ID NO: 7(2294个碱基)
      编码融合到人α(I)胶原T2 C-前肽的人胎盘碱性磷酸酶(AP)(AP-T2)的核苷酸序列。粗体密码子代表融合蛋白的起点和终点。下划线序列表示用于融合构建物的限制位点。标记序列中部所示的融合位点的限制位点是Bgl II。
      SEQ ID NO: 8(755个氨基酸)
      预测的AP-T2融合体的蛋白质序列。蓝色的氨基酸残基表示人胎盘碱性磷酸酶(AP)与α(I)胶原T2多肽间的融合位点。红色的氨基酸残基表示经突变的BMP-1蛋白酶识别位点的位置。
      SEQ ID NO: 9(1734个碱基)
      编码融合到人α(I)胶原的T0 C-前肽的人可溶性TNF-RII(sTNF-RII-T0)的核苷酸序列。粗体密码子代表融合蛋白的起点和终点。下划线序列表示用于融合构建物的限制位点。标记序列中部所示的融合位点的下划线序列是BamH I/Bgl II连接接界。
      SEQ ID NO: 10(566个氨基酸)
      预测的人可溶性TNF-RII-T0融合体的蛋白质序列。蓝色的氨基酸残基表示人可溶性TNF-RII与α(I)胶原T0多肽间的融合位点。下划线序列代表人α(I)胶原C-前肽上游的“甘氨酸重复”区。红色的氨基酸残基表示BMP-1蛋白酶识别位点。
      SEQ ID NO: 11(1542个碱基)
      编码融合到人α(I)胶原的T2 C-前肽的人可溶性TNF-RII(sTNF-RII-T2)的核苷酸序列。粗体密码子代表融合蛋白的起点和终点。下划线序列表示用于融合构建物的限制位点。标记序列中部所示的融合位点的下划线序列是BamH I/Bgl II连接接界。
      SEQ ID NO: 12(502个氨基酸)
      预测的人可溶性TNF-RII-T2融合蛋白的蛋白质序列。蓝色的氨基酸残基表示人可溶性TNF-RII与α(I)胶原T2多肽间的融合位点。红色的氨基酸残基表示经突变的BMP-1蛋白酶识别位点的位置。
      SEQ ID NO: 13(2139个碱基)
      编码融合到人α(I)胶原T0 C-前肽的人可溶性CD4的核苷酸序列。下划线序列表示用于融合构建物的限制位点。标记序列中部所示的融合位点的下划线序列是Bgl II位点。
      SEQ ID NO: 14(699个氨基酸)
      预测的人可溶性CD4-T0融合体的蛋白质序列。蓝色的氨基酸残基表示人可溶性CD4与α(I)胶原T0多肽间的融合位点。下划线序列代表人α(I)胶原C-前肽上游的“甘氨酸重复”区。红色的氨基酸残基表示BMP-1蛋白酶识别位点。
      SEQ ID NO: 15(1947个碱基)
      编码融合到人α(I)胶原T2 C-前肽的人可溶性CD4的核苷酸序列。下划线序列表示用于融合构建物的限制位点。标记序列中部所示的融合位点的下划线序列是Bgl II位点。
      SEQ ID NO: 16(635个氨基酸)
      预测的人可溶性CD4-T2融合体蛋白质序列。蓝色的氨基酸残基表示人可溶性CD4与α(I)胶原T2多肽间的融合位点。红色的氨基酸残基表示经突变的BMP-1蛋白酶识别位点的位置。
 7)优选具体实施方式(可与第4部分合写;尽量写明所有同样能完成发明目的的替代方案,所述替代可以是部分结构、器件、方法步骤的替代,也可以是完整的技术方案):
      对于产品发明应描述产品构成、电路构成或者化学成分、各部分之间的相互关系、工作过程或操作步骤;对于方法发明应写明步骤、参数、工艺条件等,可提供多个具体实施方式。
发明详述:
      在阐述本发明之前,先阐述下文将使用的某些术语的定义可能有助于理解本发明。
      DNA构建物:通常是质粒或病毒载体形式的单链或双链DNA分子,其经过重组DNA技术修饰含有以一定方式连接的DNA节段,所述连接方式使其作为整体不会存在于自然界。DNA构建物含有指导表达和/或分泌所编码的目的蛋白质所需的信息。
      信号肽序列:起到指导成熟多肽或蛋白质从细胞分泌的作用的一段氨基酸序列。信号肽的特征在于疏水氨基酸核心,并且通常发现于待分泌或锚定在细胞表面上的新近合成蛋白质的氨基末端。信号肽通常在分泌期间从成熟蛋白切割下来。这种信号肽含有的加工位点使得当其经过蛋白分泌途径时信号肽可以从成熟蛋白切割下来。信号肽序列当连接到另一种无信号肽的蛋白质的氨基末端时,可以指导融合蛋白的分泌。大部分分泌性蛋白质,例如生长因子、肽激素、细胞因子和膜蛋白(例如细胞表面受体),当合成为新生蛋白质时含有信号肽序列。
      可溶性受体:细胞表面受体的部分或全部胞外结构域,其能够结合其配体。其通常不含有任何一段负责膜锚定的内部疏水性氨基酸序列。
      胶原的C-前肽:胶原的C-末端球状非三股螺旋结构域,其能够自组装为三聚体。与胶原的三股螺旋区相反,C-前肽不含有任何甘氨酸重复序列,并且通常在前胶原分泌时胶原原纤维形成之前经蛋白酶解从前胶原前体除去。
      甘氨酸重复:胶原的中央线性三股螺旋形成区,其在氨基酸序列中含有数百个(Gly-X-Y)n重复。这些重复在X或/和Y位置也富含脯氨酸。在N-前肽和C-前肽除去时,含甘氨酸重复的胶原三股螺旋可以组装为更为有序的不溶性胶原原纤维,其构成细胞基质的主要组分。
      cDNA:代表互补DNA或者说与信使RNA互补的DNA序列。总体来说,cDNA序列不含有任何内含子(非蛋白质编码)序列。
      在本发明之前,几乎所有的治疗用抗体和可溶性受体-Fc融合蛋白(例如Enbrel)都是二聚体结构(图1)。尽管已证明这些分子与其单体对应物相比以更高的亲合力结合其靶抗原或配体,但是由于结构限制,预计它们仍不能完全其结合其具有同型三聚结构的靶标。这种治疗上重要的三聚配体的实例包括TNF家族的细胞因子和HIV外被蛋白gp120。因此,从结构角度来说,希望也可以产生可完全对接其靶标三聚配体或抗原(图1)从而完全封闭配体活动的三聚可溶性受体或抗体。期望这种三聚可溶性受体或嵌合抗体对其靶标具有最高亲和力,并且因此可以更加有效果和有效率地治疗例如关节炎和AIDS的疾病。
      本发明公开通过将其融合到胶原的C-前肽(其能够自组装为三聚体)来产生这种分泌性三聚受体和生物活性蛋白质的方法。以下为本发明的优点:(1)胶原是哺乳动物体内所分泌的最丰富的蛋白质,构成将近25%的体内总蛋白质;(2)胶原的主要形式天然以三聚螺旋出现,其球状C-前肽负责三聚化的引发,其随后在三股螺旋形成时经蛋白酶解切割;(3)据发现,胶原的被切割可溶性三聚C-前肽在哺乳动物血液中天然为亚微克/毫升水平;(4)胶原的线性三股螺旋区可作为接头而被包括,或者被排除作为融合蛋白的一部分,因此可以精确调节待三聚化蛋白与胶原C-前肽之间的距离,以获得最佳生物活性;(5)可使从前胶原切割下来的C-前肽的BMP 1的识别位点突变或删除,以防止三聚融合蛋白被破坏;(6)C-前肽域提供通用亲和标记物,其可以用于纯化本发明所制造的任何分泌性融合蛋白;(7)与已知具有其它生物功能(例如结合其自身细胞表面受体)的IgG1 Fc标签不同,胶原C-前肽的仅有已知生物功能是其引发新生前胶原链的三聚化并在新近产生的前胶原三聚体组装为不溶性细胞基质之前保持可溶的能力。胶原C-前肽的这种独特特性意味着此独特三聚化标签不可能有毒性或免疫原性,这使其成为治疗应用的理想候选者。
      为了证明制造分泌性三聚融合蛋白的可行性,使用购自美国模式培养物保藏所(ATCC)的EST克隆,通过RT-PCR扩增编码人α1(I)完整C-前肽的cDNA序列,所述人α1完整C-前肽含有一些甘氨酸重复三股螺旋区(T0构建物,序列ID No. 1-2),或不含甘氨酸重复但具有突变的BMP-1识别位点(T2构建物,序列ID No. 3-4)。将所扩增的cDNA各自作为Bgl II-XbaI片段克隆进pAPtag2哺乳动物表达载体内(GenHunter Corporation; Leder等人, 1996和1998),以代替AP编码区(图2)。所产生的载体分别称为pTRIMER T2和T0。所述载体使得任何编码可溶性受体或生物活性蛋白的cDNA模板在唯一的Hind III和Bgl II位点处可以方便地进行框内融合。与天然前胶原类似,这种融合蛋白具有位于C末端的胶原三聚化标签。
      实施例1:
      为了证明本发明的可行性,将编码人分泌性胎盘碱性磷酸酶(AP)的cDNA(包括其天然信号肽序列)从pAPtag4载体(GenHunter Corporation; Leder等人, 1996和1998)上作为Hind III-Bgl II片段切下,并且克隆进pTRIMER-T0和pTRMER-T2载体的相应位点。所产生的AP-胶原融合构建物(序列ID No. 5-8)在转染HEK293T细胞(GenHunter Corporation)之后在其中进行表达。可容易地用所转染细胞的条件培养基通过AP活性分析来测定AP-胶原融合蛋白的成功分泌。在转染2天后,AP活性达到约1单位/毫升(或者相当于约1 μg/mL融合蛋白)。为了获得稳定表达融合蛋白的HEK293T细胞,在与嘌罗霉素(puromycine)抗性载体pBabe-Puro(GenHunter Corporation)共转染之后,选择稳定克隆。将表达AP活性的克隆扩增并且保存,以供长期生产融合蛋白。
      为了确定AP-胶原融合蛋白是否组装为二硫键连接的三聚体,将单独含有AP或者含有AP-T0与AP-T2融合体的条件培养基在不含β-巯基乙醇(非还原)或含有β-巯基乙醇(还原)的SDS样品缓冲液中煮沸,通过SDS PAGE分离,并用抗AP多克隆抗体(GenHunter Corporation)进行Western印迹分析。无融合体的单独AP在非还原和还原条件下均显示为67 kDa条带,如所预期其与缺少任何分子间二硫键的情况一致(图3A)。相反,所分泌的AP-T0和AP-T2融合蛋白显示在非还原条件下(约300 kDa)是在还原条件下(90-100 kDa)的三倍大,表明两种融合蛋白均完全组装为同型三聚体(图3A)。此结果实质上使本发明的概念能付诸实践。
      实施例2:
      为了提供证据证明可以赋予三聚融合蛋白新的治疗上有益的生物功能,接着用购自ATCC的相应EST克隆构建三聚可溶性TNF-RII(p75)受体。如实施例1所描述,将人TNF-RII的N-末端区(包括完整配体结合区但排除跨膜结构域)作为Bam HI片段框内克隆进pTRIMER-T0和pTRIMER-T2载体的Bgl II位点(序列ID No. 9-12)。所产生的融合构建物在转染HEK293T细胞之后在其中表达。如实施例1所描述,通过嘌罗霉素共选择获得稳定克隆。在非还原条件和还原条件下均进行Western印迹分析,以确定所产生的可溶性TNF-RII-胶原融合蛋白是否确实表达、分泌且组装为三聚形式。如所预期,抗人TNF-RII的单克隆抗体(购自R & D Systems, Inc.的克隆226)明显识别由T0和T2融合载体表达为220-240 kDa条带的三聚可溶性TNF-融合蛋白,所述三聚可溶性TNF-融合蛋白大约是相应单体融合蛋白的三倍大(图3B)。在还原条件下,TNF-RII抗体未能检测单体融合蛋白,这符合抗体厂商所说明的特性。作为抗体特异性的阴性对照,单独HEK293T细胞及表达AP-T2融合蛋白的细胞均不表达任何TNF-RII(图3B)。
      为了确定三聚可溶性TNF-RII受体是否是其三聚配体TNF-α的有效抑制剂,基本上如前所述用细胞因子敏感细胞系WEHI-13VAR(ATCC)进行TNF-α生物测定(Mohler等人, 1993)。图4所示的结果清楚表明,三聚可溶性TNF-RII-C-前肽融合蛋白在放线菌素D(500 ng/mL)(Sigma)存在下极为有效地中和TNF-α介导的WEHI-13VAR细胞的细胞凋亡。当使用0.5 ng/mL的TNF-α(R & D Systems)时,三聚可溶性TNF-RII-T2(均来自无血清培养基或为纯化形式)具有约2 ng/mL或8×10-12 M(假设240 kDa的分子量属同型三聚体)的表观Ki-50(50%抑制)。此对TNF-α的亲和力比单体TNF-RII四个大数量级,比二聚可溶性TNF-RII-Fc融合体(例如Enbrel)大至少10-100倍(Mohler等人, 1993)。
      此关键性实施例证明,本发明可以制造具有新的生物特性的三聚融合蛋白,其可能具有极大治疗应用。可以证明,这种可溶性三聚人TNF受体在治疗自身免疫疾病(例如RA)中比当前市售的二聚可溶性TNF受体(例如Enbrel)更为有效。三聚TNF受体的极大提高的效价可以大大减少每个患者每周所注射的TNF阻断剂的量,同时有改善治疗并显著降低患者的花费。三聚TNF受体的改善的效价也应该能缓和目前二聚TNF受体生产中存在的瓶颈,所述生产目前仅可满足治疗美国约100,000个患者的需求。
      实施例3:
      作为AIDS病因的HIV病毒主要感染并破坏我们身体内特殊谱系的T淋巴细胞。这些所谓的CD4+ T细胞表达称为CD4的细胞表面蛋白,其是HIV的受体。HIV通过其结合CD4的病毒外被蛋白gp120识别CD4+细胞。值得注意的是,gp120作为巨大的同型三聚复合体存在于病毒表面上,而CD4是细胞表面上的单体。目前提出的HIV感染模式是,病毒RNA进入细胞需要HIV与CD4+ T细胞的完全对接,此时gp120三聚体的所有三个亚单位均各结合至CD4。显然,一种阻止HIV感染的直接了当的策略是用可溶性CD4来蒙蔽病毒。确实,已经证明这种使用单体可溶性CD4和CD4-Fc融合体的方法在抑制实验室分离物的HIV感染中十分有效(Clapham等人, 1989; Daar等人, 1990)。可惜的是,这些可溶性CD4在阻止AIDS患者中所发现的HIV病毒株的感染中不够有效,这可能是由于gp120氨基酸序列变异降低与单体CD4和二聚可溶性CD4的亲和力所致。
      为了显著提高可溶性CD4与HIV病毒上的任何gp120变异体的亲和力,理想的是,可溶性CD4应是三聚形式,以使其可完全对接至其三聚配体即gp120同型三聚体。与AIDS作斗争的一个主要难题在于病毒基因组的高突变率,其导致药物抗性。因此,由于病毒突变,直接靶向例如HIV逆转录酶(例如AZT)和蛋白酶的病毒基因的任何药物可能被致无效。相反,无论其突变程度多少,HIV病毒都不得不结合细胞CD4受体来引发感染。因此,高亲和力可溶性CD4三聚体应该不受病毒突变的影响,因为病毒在gp120基因中的突变将使得病毒既不能结合三聚可溶性CD4,也不能结合细胞上的CD4。
      为了制造这种三聚可溶性CD4 HIV受体类似物,使用购自ATCC的EST克隆,扩增编码完整人可溶性CD4的cDNA,其包括其天然信号肽序列,但排除掉跨膜结构域和短胞质结构域。随后将所产生的cDNA作为Hind III-Bgl II片段克隆进pTRIMER-T0和pTRIMER-T2表达载体的相应位点。所产生的可溶性CD4-胶原融合构建物(序列ID No. 13-16)在转染HEK293T细胞(GenHunter Corporation)之后在其中进行表达。为了获得稳定表达融合蛋白的HEK293T细胞,在用嘌罗霉素抗性载体pBabe-Puro(GenHunter Corporation)共转染之后,选择稳定克隆。将表达融合蛋白的克隆扩大并保存,以供长期生产融合蛋白。
      为了确定可溶性人CD4-胶原融合蛋白是否组装为二硫键连接的三聚体,将含有可溶性CD4-T0与CD4-T2融合体的条件培养基在不含β-巯基乙醇(非还原)或含有β-巯基乙醇(还原)的SDS样品缓冲液中煮沸,通过SDS PAGE分离,并用抗人CD4的单克隆抗体(R & D Systems)进行Western印迹分析。证明所分泌的可溶性CD4-T0和CD4-T2融合蛋白在非还原条件下(约300 kDa)均是在还原条件下(90-100 kDa)的三倍大,表明其基本上完全组装为同型三聚体(数据未显示)。然后可容易地测试这些三聚可溶性CD4的gp120结合和抗HIV感染情况。


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